網はかけても・・・。

今日の業務実績をご報告。

TCSでハプロタイプネットワークがかけました！
やったね！
ｖ（＾＾）ｖ

とにもかくにも、原因は、phyファイルやNEXUSファイルが、Tcsの読めるように書けない、ということでした。原因と解決法の覚書は、以下。

・塩基数が間違っていた→
　なんでか、MEGAで確認した塩基数や、phyで書きだされる塩基数が間違っていて、結局、ワードでカウントした文字数を入れたら、ランできた。

・読めない文字が入っているとのエラー→
　gap（fasファイルだとハイフン）のある個体とない個体は混在しないように、解析の配列の選び方を工夫する
　・・・readmeには、
「Version 1.21 (30 June 2005)

• Fixed the mapping code to deal with gaps correctly as defined in the GUI, either as 5th state or as missing (IUPAC ambiguity characters are always treated as missing data).」

って。ちゃんと最初から読めば、ヨカタ。でも、るまんどのデータでは、このGAPが、個体差を示すのに結構、重要な時もあるんだけど・・・これは、後々、NETWORKと比較するとかで、要検討です。

・また、配列名は9文字以内にし、配列名と配列との間にスペースを入れること（ちゅまり、最低限最後に1スペースを入れて、合計で10文字を配列名とすること）

最初は、phyファイルや、NEXUSファイルを作成すればよいのだな～と思って、web上のReadseqやClustalWを利用しましたが、彼らからoutputされる各ファイルは、どれもTcsには嫌われました・・・。あと、MEGA５もphyファイルの作成は可能でしたが、Tcsは知らん顔。

(;´д｀)ﾄﾎﾎ…。

だもんで、exampleのファイルデータを開いて自分のデータと並べて、間違い探しをすることに・・・、

するってぇと、上記のミスの他、なんか、どちらも、同じ形式なのに中身が違う・・・。んで、それらには、”方言”があることが判明（下記のURLを参照）しました。

んもー、しょうがないので、fasファイルをワードパットで開いて、exampleのphyファイルと同じになるように、文字検索・置換とかしちゃいまいした、です。

つまり、るまんどは、結局は力づくでファイル作成をやってしまっちたのですが、そこにいたるまでには、多くのHPにおせお世話になりました。

感謝の気持ちを込めて、ここに紹介いたします。

web上のreadSeq

http://www.ebi.ac.uk/Tools/sfc/readseq/

ファイル変換のいろいろ。今回に限らず、いつもお世話になっています。

http://www.fifthdimension.jp/wiki.cgi?page=Non-Interleaved%A4%CAPHYLIP%A5%D5%A5%A1%A5%A4%A5%EB%A4%F2%BA%EE%A4%EB

http://www.fifthdimension.jp/documents/molphyhandbook/molphyhandbook.pdf

DDBJはデータベースだけでなく、ClustalWもweb上で使わせてくれることが分かりました。

http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/

他にもソフトのことなど。

https://sites.google.com/site/takayaiwasakieuotaka/software

さてさて、ハプロタイプ網の図は書けたけど、これがなにゃら意味不明で。

(;´д｀)ﾄﾎﾎ…。

旅は～、まだ～、終わら～ない～ぃ♪

へ～どら～い、ているら～い～♪

と言うわけで、次は、NETWORｋ、Cytoscape、Spritstreeにも挑戦しようと思います。

ファイル変換なんか、怖くない～、ぞと。

QIAGEN Multiplex PCR Kitの注意点

あ、どうも。

QIAGEN Multiplex PCR Kitには、良く似た製品がいくつかあるのをご存じでしょうか？
・・・うちはみごとに、さっきまで、ご存じなかったです。

つーか、みんな同じもの（後続品とか）だと思っていました。
（T_T)

QIAGEN のHPで、Multiplexを検索すると、９種類くらいのPCR酵素が検索されます。

以下、こんな感じで。

１）QIAGEN Multiplex PCR Kit
至適化なしに特異性および感度の高いマルチプレックスPCR


２）QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit
高度なアプリケーションで良好な結果を簡便に実現するマルチプレックスPCR

 
３）Type-it Microsatellite PCR Kit
マイクロサテライト遺伝子座の迅速で確実なマルチプレックスPCR解析

 
４）dNTP Set and dNTP Mix, PCR Grade
For sensitive and reproducible PCR and RT-PCR

 
５）miScript Microfluidics PCR Kit
For real-time PCR profiling of miRNAs using the Fluidigm BioMark System

 
６）miScript Microfluidics PreAMP Kit
For preamplification of cDNA from low-RNA samples prior to real-time PCR miRNA analysis using the Fluidigm BioMark System



７）miScript PreAMP Pathway Primer Mix
For use with the miScript PreAMP PCR Kit


８） miScript miRNA PreAMP PCR Kit (12)
miScript PreAMP PCR Kit
For preamplification of cDNA from samples containing low RNA amounts prior to real-time PCR analysis of miRNA

 
９）Type-it Mutation Detect PCR Kit
マルチプレックスPCRにより変異を高い再現性で正確に解析


で、るまんどは、リアルタイムPCRとかはやってないので、４）以下はほとんど関係ないのです。
問題は、１）～３）・・・。うちは、きちんと使い分けていなかった可能性があ、る・・・。
およよよ、(＠_＠;)


ダウンロードできるプロトコルを比較してみたところ、
　・　premixの配合割合　同じ
　・　推奨のプライマ濃度、アニリング温度　同じ
　・　推奨のテンプレートDNA量　１）と２）は300～0.1/PCR反応、３）は200～0.1
　・　推奨のサイクル数　１）と２）は30～45、３）は20～32（テンプレート量に依存）
　・　最初の活性化ステップ　１）は95℃、15 分間、２）は95℃、5 分間、３）は95℃、5 分間
　・　推奨の最終エクステンション　キャピラリーシーケンサーを使う場合、同じ
　・　推奨の反応系　１）と２）は50μL、３）は25μL
　・　Q-solution　いずれも添付
　・　価格　１）は（１００×50μL）３．６万、２）は(100×50μ）3.05万、３）は(200×25μL）3.05万
　・　１）でもマイクロサテライトに使用可能、３）はマイクロサテライトに最適化されている、２）はマイクロサテライトを推奨していない（プロトコルを良く読むと、３）を使うように注意書きがこそっとしてる！）
　・　最大マーカー数の成功例　１）は16（ただしマイクロサテライト領域なのかどうかは不明）、２）は19、３）は10

ざっと、こんな感じ。

マイクロサテライトのみ、解析する場合には３）を使えばよいだろう、
１）の汎用性は高いので、一般的なフラグメントとマイクロサテライトを混在した解析（やったことないけど）には良いと思われるが、最初の活性化に多少時間がかかる、なんかちょっと単価が高いなど、が難点


マイクロサテライトはつまり繰り返し配列なので、３）で最適化してあるのは、繰り返し配列のPCRでエラーを起こさないように、酵素になにがしかの魔法をかけているんじゃない？


しかし、まぎらわしいわ～っ！


と怒りつつも、自分の不注意さを反省・・・。


（T＿T)

KOD-FXとシーケンス

ほんとに久しぶりの更新です。
実験の小箱としてお役にたてられるかも？の情報をお知らせします。

KOD－FXでPCRしたテンプレートを、そのままシーケンシング（BigDye3.1)すると、うまく配列を読んでくれない、という悩みは、あちこち（主に多細胞生物）から聞こえていたので、

うちだけではないのか～と、でも、解決はできないのか～と、もんもんとしていたのですが、

このたび、なんとなく解決できたうちのプロトコルを紹介します。

１）各生物にあった条件通り、KOD-FXでPCRする
２）PCR後のテンプレートを５～１０、もしくは20倍程度に希釈する。
３）希釈したテンプレートをExo-SAP（もしくはillustra ExoProStar）で、プロトコルどおりにインキュベートする。
４）３）をシーケンス用テンプレートとして使って、あとは、BigDye3.1のプロトコルどおりにサイクルシーケンスする。


という感じです。

うちの扱っているサンプルでは、この方法で９５％くらい解決しました。


KOD－FXでPCRしたテンプレートは、そのままだとなぜシーケンシング失敗率が高いのか、の理由については、

あ）PCR効率があがる（＝PCR産物がたくさんできる）ので、テンプレートをシーケンス用に適切な濃度にする必要がある

い）KOD-FXの粘性の高いバッファーが、ExoもしくはBigDye3.1の邪魔をしている。


なんじゃないかと推測しています。

あ）については、BigDye3.1のマニュアルにも「テンプレートの濃度はちゃんとしてね」と書いてますが（そしてその場合のピークパターンの例も紹介されている）、経験的には、KOD-FXの場合はどうもテンプレートの濃度が濃すぎるだけの理由ではないようなので、プライマーを非活性化させる段階から希釈してやってみたら、あたり～な感じでした。



他の方は、PCR後にエタ沈するとか、TOYOBO推奨の精製キット（MagExtractorTM-PCR& Gel Clean up-）を使うとか試行錯誤されているようです。
けど、とにかくうちは簡単に（安く）できないものかと思って、希釈という方法にたどりつきました。
それに、他の試薬を使うと、さらになんの相性が悪いのかわかんなくなりそうなので・・・。



成功率が95％は、低い？

たぶん・・・、個々の濃度に合わせて希釈をしていけば、シーケンスの成功率は上がるのではないかと思います。
うちはめんどくさかったので、アガロースで濃度確認して、まーこんなもんかーと毎回一律で、5倍とか、10倍とか、20倍希釈でやったのが原因ではないかと思っています。

結局こりずに・・・、またそういうてきとうなことを・・・やってます、すいません～。
＾＾；）

KOD_FXのこととか。

実験覚書として始めたブログですが、長いこと放置してしまった・・・。
スンマセン。

今日は、TOYOBOのKOD_FXのお話です。

実験友達に薦められて使い始めたのですが、

結論から言うと、「某TKR exTaqでPCRがうまくいかなかったサンプルでも、PCRできるようになる！！！」です。特に、お魚のサンプルで有効です。DNAゾルダイレクトでの抽出液でもそのままテンプレートとして使えますた。すばらしい！

調子に乗って、他のサンプルもPCRしてみたら・・・

＠＠；）


PCRの後の液中に、なんかこう、どろっとしたもんができあがってしまいました。スライムみたいなやつです。びっくりしたよ、もう。しかも、PCR成功率は25％くらいに激減。


えー。

＝＝）


いろいろ検索してみると、PCR時間が長くなると、KODのバッファーのせいで？PCR液がとろみを帯びてくるみたいです。でも、イマドキのチューブだからふたもしっかりしてるはずだし、水分がとぶからとか、考えにくいのですが・・・。もしかすると、うちのサンプルに糖類？が多いせいかもしれません。


はっきりしたことは分かりませんが、2匹目のドジョウはなかなかつかまらない、ってやつですな。

ふむ。

サイクル前の3分

PCRは、熱変性・アニーリング・伸長と、温度を変化させることを、30~40サイクル繰り返したりしますが、そのサイクルの前の熱変性が意外とカギになることがあります。


とある論文で、熱変性させないといけない酵素付きのDNAポリメラーゼを使ってPCRをやっているのを見かけました。PCRサイクル前に10分間の熱変性を行っているのは、そのDNAポリメラーゼを使っているからだと思いました。

酵素修飾のない別の酵素を使い、その10分を1分に省略した方法でPCRしたところ、


全くバンドが出ませんでした。


なんでやねん。
(＠_＠;)



いろいろ考え、多くの時間とDNAポリメラーゼを無駄にした結果、



もしかして、あの10分には、他の意味があるのでは・・・？と思い、でも、DNAポリメラーゼがへたるのが、心配だったので、3分だけ、サイクルの前に熱変性をかけることにしました。



す、すると・・・。


バンドが出ました！！！

!(^^)!


身近な教科書を読みなおしてみたら、「変性しにくい配列の時は、熱変性の温度を上げるか、サイクルの前に、数分間の変性を行うとよい場合がある」と書いてありました。

ふむふむ。



・・・以上、困った時は基本に帰ろう、というお話でした。

染めて（GG)、光らせて（LED)。

せっかく新しくするなら・・・ということで、UVとエチブロに代わる、安全な染色方法を採用することにしました。

エチブロの発がん性は、そこかしこで指摘されていることですし・・・。UVをうっかり見ちゃったら大変なことになりますし。チャンスがあれば切り替えたいな～と常々思っておりまして。


問題は、エチブロ＋UVと同等か、それ以上の感度とそれ以下のコストで賄えるものがあるのかしら～？という点です。


いろいろ探して、私がいきついたのがコレデス↓。
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/GRGG.htm

GelGreen。なかなかよろしいです。今のところ、特に問題なく使っていますです。エチブロと比べて、そんなに感度も変わらない気がします。プレステイン(プレキャスト：ゲルにまぜて使う方法）ができるので、染色の時間が節約できるのもなかなかよろしいと思います（この辺の便利さは、使ってみて分かりました）。1万倍希釈で、0.5ｍｌ入りだから、５０mlゲルだと、１０万枚も作れます（計算あってます？）。

LEDの方は、小さくて場所を取らない（そして安価な）ものでにしました↓。こちら
http://www.mecan.co.jp/original/genetic/bi-pyra.htm


予算の範囲内で、できるだけいいデジカメをつけたのですが、やっぱり、美しさは某社のCCDカメラにかなわないかなーというところです。けど、論文のFigとしてぎりぎりOKの美しさかなと思っています。

・・・もしかしたら、カメラの設定をどこか変えたら今よりも美しくなるかも・・・。しかしどこを？
(?_?)


細かいところに多少の不便はありますが、慣れればなんてことない・・・という感じです。

キレものキレックス。

いかにDNA抽出を安く簡単にするか！は大事なテーマだと思います。

るまんどが扱っているのは、動物なので、植物ほど「壁」は厚くないのですが、それでもタンパクだとか多糖やらをPCR系に持ち込んでしまうと、増幅を阻害されることはしょっちゅうです。

るまんどの扱っている生き物では、キア源さんは決して万能な抽出方法ではなく、24個体（8×3）を抽出(精製）したのに、バンドは１つ・・・みたいなこともありました(＠_＠;)。

いくら無駄にしたか？
400円かけるサンプル数、+プラスチックごみ処理費用・・・です。


そんな中、先日、実験の師匠から、「キレックス、けっこういいよ！」との伝令が！

さっそく試したところ、たしかにいいっす！
!(^^)!

なんせ、５％のキレックスを入れて、あっためたら(９０℃で１０~１５分）抽出終了！っていう手軽さがいいです。


発売元のHPを見ますと、キレックスそのものは、キレート剤なのでPCRを阻害するタンパクたちが必要とする「金属をキレートしちゃう働きだけを持っている」そうです。

つまり、この方法は粗抽出なので、PCRだけを目的とする場合は有効だけど、きれいなDNAからいろいろやろうとする場合には、エタ沈などの作業が必要になってきます。

サンプルをどろどろにしたいときはProKと組み合わせて使ったり、長期保存の場合は精製してTE(もしくはAE）で保存するなどしてます。

なにせ、さっさとPCRしちゃうときは、そのまま使っちゃえる気軽さがいいで～す。

しかも、安いときたもんだ～♪


注）キア源さんが必ずしも万能でないというのは、るまんどの経験則（ある生物のくせ？）なので、営業妨害とかで訴えたりしないでね。扱う生物によってはかなりいいらしいので。

AEの中身。

キア源さんのAEって、中身はTEだらうなぁ～と思っていたのけど、自信がなかったので調べてみました。

カタカタ～と検索してみると、キ☆ゲンさんは日本で特許を取っているということが分かりました。その申請書類の中には、

AE（10ｍM　Tris-HCl　PH9.0、0.5ｍM EDTA）

って、書かれてありました。おぉぉぉ。ネット社会って、すごい。
!(^^)!


るまんどが愛用している「どーじん」さんのTEは、10×TE（PH8.0）で、中身は0.1M　Tris-HCl and 10ｍM EDTAなので、AEは、EDTAをけちってアルカリよりに調整した試薬と考えてよさそうです。


DNAは基本アルカリ中で安定だと言われていますが、PCR溶液がアルカリだと増幅を阻害する可能性もあるので、添加するテンプレートの量に気をつけないといけないかも。

あ、キア源さんと同じように扱えば問題ないのか。

これで、残ってるAEをTEのアルカリっぽいのとして有効利用できますな。


(-。-)y-゜゜゜