KOD-FXとシーケンス

ほんとに久しぶりの更新です。
実験の小箱としてお役にたてられるかも？の情報をお知らせします。

KOD－FXでPCRしたテンプレートを、そのままシーケンシング（BigDye3.1)すると、うまく配列を読んでくれない、という悩みは、あちこち（主に多細胞生物）から聞こえていたので、

うちだけではないのか～と、でも、解決はできないのか～と、もんもんとしていたのですが、

このたび、なんとなく解決できたうちのプロトコルを紹介します。

１）各生物にあった条件通り、KOD-FXでPCRする
２）PCR後のテンプレートを５～１０、もしくは20倍程度に希釈する。
３）希釈したテンプレートをExo-SAP（もしくはillustra ExoProStar）で、プロトコルどおりにインキュベートする。
４）３）をシーケンス用テンプレートとして使って、あとは、BigDye3.1のプロトコルどおりにサイクルシーケンスする。


という感じです。

うちの扱っているサンプルでは、この方法で９５％くらい解決しました。


KOD－FXでPCRしたテンプレートは、そのままだとなぜシーケンシング失敗率が高いのか、の理由については、

あ）PCR効率があがる（＝PCR産物がたくさんできる）ので、テンプレートをシーケンス用に適切な濃度にする必要がある

い）KOD-FXの粘性の高いバッファーが、ExoもしくはBigDye3.1の邪魔をしている。


なんじゃないかと推測しています。

あ）については、BigDye3.1のマニュアルにも「テンプレートの濃度はちゃんとしてね」と書いてますが（そしてその場合のピークパターンの例も紹介されている）、経験的には、KOD-FXの場合はどうもテンプレートの濃度が濃すぎるだけの理由ではないようなので、プライマーを非活性化させる段階から希釈してやってみたら、あたり～な感じでした。



他の方は、PCR後にエタ沈するとか、TOYOBO推奨の精製キット（MagExtractorTM-PCR& Gel Clean up-）を使うとか試行錯誤されているようです。
けど、とにかくうちは簡単に（安く）できないものかと思って、希釈という方法にたどりつきました。
それに、他の試薬を使うと、さらになんの相性が悪いのかわかんなくなりそうなので・・・。



成功率が95％は、低い？

たぶん・・・、個々の濃度に合わせて希釈をしていけば、シーケンスの成功率は上がるのではないかと思います。
うちはめんどくさかったので、アガロースで濃度確認して、まーこんなもんかーと毎回一律で、5倍とか、10倍とか、20倍希釈でやったのが原因ではないかと思っています。

結局こりずに・・・、またそういうてきとうなことを・・・やってます、すいません～。
＾＾；）