サイクル前の3分

PCRは、熱変性・アニーリング・伸長と、温度を変化させることを、30~40サイクル繰り返したりしますが、そのサイクルの前の熱変性が意外とカギになることがあります。


とある論文で、熱変性させないといけない酵素付きのDNAポリメラーゼを使ってPCRをやっているのを見かけました。PCRサイクル前に10分間の熱変性を行っているのは、そのDNAポリメラーゼを使っているからだと思いました。

酵素修飾のない別の酵素を使い、その10分を1分に省略した方法でPCRしたところ、


全くバンドが出ませんでした。


なんでやねん。
(＠_＠;)



いろいろ考え、多くの時間とDNAポリメラーゼを無駄にした結果、



もしかして、あの10分には、他の意味があるのでは・・・？と思い、でも、DNAポリメラーゼがへたるのが、心配だったので、3分だけ、サイクルの前に熱変性をかけることにしました。



す、すると・・・。


バンドが出ました！！！

!(^^)!


身近な教科書を読みなおしてみたら、「変性しにくい配列の時は、熱変性の温度を上げるか、サイクルの前に、数分間の変性を行うとよい場合がある」と書いてありました。

ふむふむ。



・・・以上、困った時は基本に帰ろう、というお話でした。

染めて（GG)、光らせて（LED)。

せっかく新しくするなら・・・ということで、UVとエチブロに代わる、安全な染色方法を採用することにしました。

エチブロの発がん性は、そこかしこで指摘されていることですし・・・。UVをうっかり見ちゃったら大変なことになりますし。チャンスがあれば切り替えたいな～と常々思っておりまして。


問題は、エチブロ＋UVと同等か、それ以上の感度とそれ以下のコストで賄えるものがあるのかしら～？という点です。


いろいろ探して、私がいきついたのがコレデス↓。
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/GRGG.htm

GelGreen。なかなかよろしいです。今のところ、特に問題なく使っていますです。エチブロと比べて、そんなに感度も変わらない気がします。プレステイン(プレキャスト：ゲルにまぜて使う方法）ができるので、染色の時間が節約できるのもなかなかよろしいと思います（この辺の便利さは、使ってみて分かりました）。1万倍希釈で、0.5ｍｌ入りだから、５０mlゲルだと、１０万枚も作れます（計算あってます？）。

LEDの方は、小さくて場所を取らない（そして安価な）ものでにしました↓。こちら
http://www.mecan.co.jp/original/genetic/bi-pyra.htm


予算の範囲内で、できるだけいいデジカメをつけたのですが、やっぱり、美しさは某社のCCDカメラにかなわないかなーというところです。けど、論文のFigとしてぎりぎりOKの美しさかなと思っています。

・・・もしかしたら、カメラの設定をどこか変えたら今よりも美しくなるかも・・・。しかしどこを？
(?_?)


細かいところに多少の不便はありますが、慣れればなんてことない・・・という感じです。